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Caesiumhydroxid
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Verfasst am: 9/4/2011, 20:29  Titel:  Quantitative Abtrennung eines Proteins Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Hallo,

ich hätte, wie unschwer erkennbar, eine Frage - und zwar stehe ich vor dem Problem, ein Protein aus wässriger Lösung quantitativ abzutrennen, ohne jedoch Fremdionen in der Lösung mit abzutrennen - d.h. einfaches abziehen des Wassers ist nicht praktikabel.

Inwiefern könnte ich mittels Ammoniumsulfatfällung das Protein möglichst quantitativ aus der Lösung entfernen?

Wäre es auch möglich, durch (mehrfache?) Dialyse die Fremdionen vom Protein abzutrennen und die Proteinlösung anschließend im Vakuum aufzukonzentrieren (Drehschieberpumpe bei Wasser und 0° C? Ich habe da persönlich Bedenken, dass das funktioniert, wie hoch müsste denn das Vakuum bei 0° C sein, damit das Wasser entfernt werden kann? Bei Google fand ich kein geeignetes, genaues Phasendiagramm.).

LG

CsOH
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Hartmut
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Verfasst am: 9/4/2011, 21:50  Titel:   Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Bei der enormen Größe von Protein-Molekülen sollte Dialyse bei Auswahl der richtigen Membran quantitativ laufen. Beim Absaugen von 0°-Wasser gefriert das Ganze natürlich erstmal sofort, aufgrund der Verdunstungskälte. Vielleicht könnte man sich innerhalb eines Kühlschranks mit Gefrierfach ja eine Vakuum-Gefriertrocknungsanlage aufbauern, deren "Verdampfer" bei 5°C steht und deren Kondensator im Gefrierfach.
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Wirehead



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Verfasst am: 9/4/2011, 22:03  Titel:   Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Wasser hat bei 0C° afaik 6mbar. Eis läst sich auch im Vakuum abziehen, dauert etwas länger, dafür hat man kein Siedeverzug. Wink
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Formalin




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Verfasst am: 9/4/2011, 22:03  Titel:   Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Zitat:
und zwar stehe ich vor dem Problem, ein Protein aus wässriger Lösung quantitativ abzutrennen, ohne jedoch Fremdionen in der Lösung mit abzutrennen


Mehrere Fragen hierzu:

• Welche Arbeitsumgebung ist gegeben (entsprechend ausgestattetes Labor oder der heimische Keller)?

• Um welches Protein handelt es sich genau? Natürlich, oder rekombinant (womöglich sogar getaggt)?

• Sind Fremdproteine vorhanden?
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Caesiumhydroxid
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Verfasst am: 9/4/2011, 22:09  Titel:   Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Zitat:
• Welche Arbeitsumgebung ist gegeben (entsprechend ausgestattetes Labor oder der heimische Keller)?


Entsprechend ausgestattetes Labor, zum einen Schullabor, zum anderen Universitätslabor.

Zitat:
• Um welches Protein handelt es sich genau? Natürlich, oder rekombinant (womöglich sogar getaggt)?


Das würde ich ungern hier erläutern, um was es sich genau handelt - es ist jedoch nicht natürlich, zur Stabilität ist daher auch nichts bekannt.

Zitat:
• Sind Fremdproteine vorhanden?


Es geht darum, sämtliches Protein aus der Lösung zu entfernen - ob es mehrere sind, ist, so bizarr es klingt, nicht bekannt.
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Formalin




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Verfasst am: 9/4/2011, 23:35  Titel:   Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Zitat:
Das würde ich ungern hier erläutern, um was es sich genau handelt


Dann wird es tendenziell eher schwierig, dir hier genaue Anweisungen geben zu können. Bedingungen, die ein bestimmtes Protein locker aushält, können ein anderes ganz schnell killen.

Zitat:
es ist jedoch nicht natürlich/ob es mehrere sind, ist, so bizarr es klingt, nicht bekannt


Wenn es nicht natürlich ist, gibt es zwei Möglichkeiten:

a) ihr habt ein natürliches Protein (mit unveränderter Sequenz) in einem Fremdhost exprimiert, oder
b) es ist sogar voll rekombinant (also Sequenz verändert, oder ein Tag wurde angehängt)

In beiden Fällen muss eigentlich bekannt sein was ihr vorliegen habt (Einzelprotein oder Mischung), da man zur Konstruktion des Expressionsvektors die DNA-Sequenz kennen muss, aus der sich dann auch die Proteinsequenz ergibt.

Zitat:
Es geht darum, sämtliches Protein aus der Lösung zu entfernen


Was soll anschliessend damit geschehen, was sind die weiteren Schritte und das Ziel?
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Alumni




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Verfasst am: 10/4/2011, 10:31  Titel:   Antworten mit ZitatNach untenNach oben

Man könnte Fachliteratur heranziehen, wenn man schon in einem Universitätslabor arbeitet, z.B. Eckert, Kartenbeck: Proteine: Standardmethoden der Molekular- und Zellbiologie. Siehe dort z.B. Kap. 1.9: Reinigung und Konzentrierung von Proteinlösungen. Unterkapitel: Dialyse, Centricon, Vakuumdialyse, Speed Vac System, Gefriertrocknung. Oder man fragt einfach jemanden, der in dem Universitätslabor arbeitet und diese Methoden seit Jahrzehnten anwendet.
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